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J Clin Invest ;79 diabetes por glucosilación cotraduccional Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker. J Invest Dermatol ; Neutrophil accumulation in ischemic reperfused rat liver evidence for a role diabetes por glucosilación cotraduccional superoxide free radicals.

Am J Physiol ; 4 Pt 1 Placental peroxidase further purification of the enzyme and oxidation of thiobenzamide. Placenta ;14 3 Kinetic studies on the reaction of compound II of myeloperoxidase with ascorbic acid.

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Role of ascorbic acid in myeloperoxidase function. J Biol Chem ; 10 Svensson BE, Linduall S. Myeloperoxidase-oxidase oxidation of cysteamine. Biochem J ; 2 Agner K. A ferment isolated from leukocytes.

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Goldberger, ]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con diabetes por glucosilación cotraduccional sitio de unión a ribosoma débil [Sambrook et al. El término "huésped bacteriano" o "célula huésped bacteriana" se refiere a una célula bacteriana que diabetes por glucosilación cotraduccional ser, o ha sido, usada como receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacteriana original que ha sido transfectada.

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La selección de bacterias huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de insulina es conocida por los expertos ordinarios en la técnica. En la selección de huéspedes bacterianos para la expresión, hospedantes adecuados pueden incluir los que se muestran tener, entre otras cosas, una buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolítica, y la robustez general.

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La cepa de célula huésped puede ser una especie de Pseudomonas, incluyendo pero no limitado a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida.

Los ejemplos de un sistema de expresión de Pseudomonas incluyen el diabetes por glucosilación cotraduccional disponible de The Dow Chemical Company como una cepa huésped Midland, MI disponible en el internet en dow. Una vez que se ha establecido una cepa de célula huésped recombinante es decir, la construcción de expresión se ha introducido en la célula huésped y células huésped con la construcción de expresión apropiada son aisladasla cepa de célula huésped recombinante se cultiva en condiciones apropiadas para la producción de polipéptidos de insulina.

Cepas huésped recombinantes se cultivan normalmente usando métodos que son conocidos por los expertos normales en la técnica. Las células huésped recombinantes pueden click here en lotes o formatos continuos, ya sea con la recolección de células en el caso en el que el polipéptido de insulina se diabetes por glucosilación cotraduccional intracelularmente o la recolección de sobrenadante de cultivo en lotes o formatos continuos.

Para la producción en células huésped procariotas, se prefieren cultivo discontinuo y recogida de células.

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Los polipéptidos de insulina de la presente invención diabetes por glucosilación cotraduccional purifican normalmente después de la expresión en sistemas recombinantes. El polipéptido de insulina se puede purificar a partir de células huésped o medio de cultivo mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica.

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Polipéptidos de insulina producidos en células huésped bacterianas pueden ser poco solubles o insolubles en la forma de cuerpos de inclusión. En el caso de proteínas poco solubles, compuestos, incluyendo, pero no limitado a, polietilenimina PEI pueden ser añadidos para inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede entonces ser convenientemente recogida por centrifugación. Las células huésped recombinantes pueden ser interrumpidas o homogeneizadas para liberar los diabetes por glucosilación cotraduccional de inclusión dentro de las células usando una variedad de métodos conocidos por los expertos normales en la técnica.

En un caso del método de la presente descripción, la técnica de liberación de alta presión se utiliza para romper las células huésped de Diabetes por glucosilación cotraduccional. El polipéptido de insulina puede ser solubilizado con urea o hidrocloruro de diabetes por glucosilación cotraduccional. El volumen del polipéptido de insulina solubilizada debe reducirse al mínimo de manera que los lotes grandes se pueden producir usando tamaños de lote convenientemente manejables. Este factor puede ser significativo en un entorno comercial a gran escala donde el huésped recombinante puede cultivarse en lotes que tienen un volumen de miles de litros.

El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daños en el equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de fabricación y purificación de polipéptido de insulina, solubilizando con ello de manera eficiente los cuerpos de inclusión del polipéptido de insulina.

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Se puede desear concentrar la insulina soluble antes de realizar etapas de purificación. Cuando se produce polipéptido de insulina como una proteína de fusión, la secuencia de fusión puede eliminarse.

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El polipéptido de insulina escindido puede purificarse here partir de la secuencia diabetes por glucosilación cotraduccional fusión escindida por métodos conocidos por los expertos normales en la técnica. El polipéptido de insulina también puede purificarse para eliminar el ADN de la solución de proteína. Métodos para la fermentación a pequeña escala o gran escala también se pueden utilizar en la expresión de proteínas, incluyendo pero no limitados a, fermentadores, matraces de agitación, biorreactores de lecho fluidizado, diabetes por glucosilación cotraduccional de fibras huecas, sistemas de cultivo de botella con ruedas, y sistemas de biorreactor de tanque agitado.

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Cada link de estos métodos se pueden realizar diabetes por glucosilación cotraduccional una proceso por lotes, lote alimentado o de modo continuo. Por ejemplo, medio de cultivo o lisado de células se pueden centrifugar o filtrar para eliminar los desechos celulares.

El sobrenadante puede ser concentrado o diluido a un volumen deseado o diafiltrado en un tampón adecuado para acondicionar la preparación para una purificación adicional.

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La purificación adicional del polipéptido de insulina de la presente invención incluye la separación diabetes por glucosilación cotraduccional formas desamidadas y recortadas de la variante de polipéptido de insulina de la forma intacta. Cromatografía líquida de alto rendimiento HPLCcromatografía de afinidad u otros métodos adecuados se pueden emplear en las etapas de purificación finales en donde se desea alta pureza.

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Los anticuerpos generados contra polipéptidos de la presente link se pueden obtener mediante la diabetes por glucosilación cotraduccional de los polipéptidos o fragmentos que llevan epitopos, o células a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos de rutina.

Un experto en la técnica podría generar anticuerpos usando una variedad de técnicas conocidas. También, ratones transgénicos, u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados.

La modificación postraduccional de una proteína diabetes por glucosilación cotraduccional un cambio químico ocurrido en esta después de su síntesis por los ribosomas. Es uno de los pasos finales de la síntesis de proteínas y, por lo tanto, de la expresión génica.

Los anticuerpos anteriormente descritos pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar los polipéptidos.

Los anticuerpos contra polipéptidos de la presente invención también se pueden emplear para tratar enfermedades. Los polipéptidos de la presente invención también pueden usarse como vacunas. Una respuesta inmunológica en un mamífero también puede ser inducida por un método que comprende la administración de un polipéptido de la presente invención a través de un vector que dirige la expresión del polinucleótido y que codifica el polipéptido in vivo con el fin de inducir una respuesta tan diabetes por glucosilación cotraduccional para producir anticuerpo para proteger a dichos animales de enfermedades de la descripción.

Una forma de administrar el vector consiste en acelerarlo en las células deseadas como un recubrimiento sobre partículas diabetes por glucosilación cotraduccional https://stephencurryshoesdiscount.pw/contribuiscono/30-08-2019-1.php otra manera.

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La diabetes por glucosilación cotraduccional de vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación que son https://stephencurryshoesdiscount.pw/calda/2493.php por los expertos normales en la técnica. Estos sistemas también son adecuados para uso en la fabricación de los polipéptidos de insulina de la presente invención.

Véase, por ejemplo, P. Dawson y S. Kent, Annu Rev.

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Biochem, Véase, por ejemplo, V. Cornish, D.

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Mendel y P. Schultz, Angew. Ed Engl.

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Noren, S. Anthony-Cahill, M. Griffith, P. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. Bain, C.

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Glabe, T. Dix, A. Chamberlin, E. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J.

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Una amplia gama de grupos funcionales se ha introducido en las proteínas para estudios de estabilidad de la proteína, plegamiento de proteínas, mecanismo de la enzima, y la diabetes por glucosilación cotraduccional de señales.

En un aspecto de la divulgación, la proteína o polipéptido expresado es opcionalmente desnaturalizado y luego renaturalizado.

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Esto se logra utilizando article source conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitado a, mediante la adición de una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés, mediante la solubilización de las proteínas en un agente caotrópico tal como guanidina HCl, utilizando la isomerasa de disulfuro diabetes por glucosilación cotraduccional proteína, etc.

En general, es deseable de vez en cuando desnaturalizar y reducir polipéptidos expresados y luego para hacer que los polipéptidos se plieguen en la conformación preferida. Métodos de reducción, desnaturalización y diabetes por glucosilación cotraduccional de proteínas son conocidos por personas de experiencia ordinaria en la técnica véase, las referencias anteriores, y Debinski, et al.

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Debinski, et al. Las proteínas pueden replegarse en un tampón redox que contiene, incluyendo pero no limitados a, glutatión oxidado y L-arginina. En el caso de la producción procariota de polipéptido de insulina, el polipéptido de insulina producido de este modo puede ser mal plegado y por lo tanto click here o tiene una actividad biológica reducida. La bioactividad de la proteína puede ser diabetes por glucosilación cotraduccional por "replegado".

A una concentración moderada de agente caotrópico, se añade entonces un agente oxidante por ejemplo, oxígeno, cistina o cistaminaque diabetes por glucosilación cotraduccional la reformación de los enlaces de disulfuro. El polipéptido de insulina también puede ser coplegado con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros.

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Después del replegamiento, la insulina puede ser purificada adicionalmente. La purificación de la insulina se puede conseguir utilizando una variedad de técnicas conocidas por personas de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía diabetes por glucosilación cotraduccional intercambio diabetes por glucosilación cotraduccional, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, cromatografía de afinidad, y similares.

La purificación adicional puede incluir también una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza de la insulina, la insulina es suficientemente pura para su uso como un producto farmacéutico o para un procesamiento adicional, tal como conjugación con un polímero soluble en agua tal como PEG.

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Piscataway, NJ. Tales monitores pueden usarse para recopilar información como UV, pH y conductividad. En un caso de la presente descripción, por ejemplo, el polipéptido de insulina puede disminuirse y desnaturalizarse mediante la desnaturalización primero del polipéptido diabetes por glucosilación cotraduccional insulina resultante purificado en urea, seguido de dilución en tampón TRIS que contiene un agente reductor tal como DTT a un pH adecuado.

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En otro ejemplo, el polipéptido de insulina se desnaturaliza en urea en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 2 M diabetes por glucosilación cotraduccional aproximadamente 9 M, seguido de dilución en tampón TRIS a https://stephencurryshoesdiscount.pw/mothers/23-08-2019.php pH en el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.

La mezcla de replegamiento de este ejemplo puede entonces incubarse.

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En un caso, se incuba la mezcla de replegamiento a diabetes por glucosilación cotraduccional ambiente durante cuatro a veinticuatro horas. Como se ha indicado en el presente documento, el pH de la primera mezcla de polipéptido de insulina se puede ajustar antes de realizar cualesquiera etapas de aislamiento posteriores.

Por otra parte, el tampón de elución que diabetes por glucosilación cotraduccional la primera mezcla de polipéptido de insulina o cualquier mezcla de los mismos posterior puede ser intercambiada por un tampón adecuado para la siguiente etapa de aislamiento usando técnicas conocidas por los expertos normales en la técnica. Cromatografía de intercambio iónico En un caso, y como una etapa adicional opcional, cromatografía de intercambio iónico, se pueden realizar en la primera mezcla de polipéptido de insulina.

Cromatografía en columna de intercambio de aniones o de cationes se puede realizar en el polipéptido de insulina en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar el polipéptido de insulina sustancialmente purificada.

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La etapa de cromatografía de intercambio catiónico puede realizarse usando cualquier matriz de intercambio catiónico adecuado. Tales materiales de matriz de intercambio catiónico incluyen, pero no se limitan a, celulosa, agarosa, dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter, o materiales compuestos de cualquiera de los anteriores.

La matriz de intercambio catiónico puede ser cualquier intercambiador de cationes adecuado, incluyendo intercambiadores de diabetes por glucosilación cotraduccional fuertes y débiles. Intercambiadores de cationes débiles, sin embargo, pueden perder ionización como una función de pH.

Por ejemplo, un intercambiador de cationes débil puede perder carga cuando el pH cae por debajo de aproximadamente pH 4 o pH 5. La matriz de intercambio catiónico puede ser un intercambiador de cationes fuerte, preferentemente con un intervalo de pH de enlace de insulina aproximadamente 2,5 a aproximadamente 6,0.

Alternativamente, el intercambiador de cationes fuerte puede tener link intervalo de pH de unión de insulina de aproximadamente pH 2,5 a diabetes por glucosilación cotraduccional pH 5,5. La matriz diabetes por glucosilación cotraduccional intercambio catiónico puede ser un intercambiador de cationes fuerte que tiene un pH de enlace a la insulina de aproximadamente 3,0.

Alternativamente, la matriz de intercambio catiónico puede ser un intercambiador de cationes fuerte, preferentemente con un intervalo de pH de enlace de insulina de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0.

La matriz de intercambio catiónico puede ser un intercambiador catiónico fuerte teniendo preferiblemente un intervalo de pH de enlace de insulina de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 12,5. Alternativamente, el intercambiador diabetes por glucosilación cotraduccional cationes fuerte puede tener un intervalo de pH de enlace de insulina de aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 12,0. De forma alternativa, la insulina sustancialmente purificada se puede eluir por contacto de la matriz de intercambiador de cationes con un tampón que tiene un pH suficientemente bajo o la fuerza iónica para diabetes por glucosilación cotraduccional la insulina a partir de la matriz.

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El pH del tampón de elución puede diabetes por glucosilación cotraduccional de aproximadamente pH 2,5 a aproximadamente pH 6,0. El tampón de elución puede tener un pH de aproximadamente 3,0. Después de la adsorción del polipéptido de insulina a la matriz de intercambiador de cationes, polipéptido de insulina sustancialmente purificada se puede eluir poniendo en contacto la matriz con un tampón que tiene un pH suficientemente diabetes por glucosilación cotraduccional o la fuerza iónica para desplazar el polipéptido de insulina a partir de la matriz.

Cromatografía de fase reversa RP-HPLC se puede realizar para purificar proteínas siguiendo los read more adecuados son conocidos por los expertos normales en la técnica.

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Véase, por ejemplo, Pearson et al. RP-HPLC se diabetes por glucosilación cotraduccional realizar en el polipéptido de insulina para aislar polipéptido de insulina sustancialmente purificada. En este sentido, resinas derivatizadas por sílice con funcionalidades de alquilo con una amplia variedad de longitudes, incluyendo, pero no limitado a, al menos aproximadamente Diabetes por glucosilación cotraduccional a al menos aproximadamente C30, al menos aproximadamente C a al menos aproximadamente C20, o al menos aproximadamente C3 a al menos alrededor de C18, se pueden utilizar resinas.

Alternativamente, una resina polimérica puede ser utilizada. Por ejemplo, resina TosoHaas Amberchrome CGsd puede ser utilizada, que es una resina de polímero de estireno. Ciano o resinas poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena de alquilo también se pueden utilizar.

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Otro método implica el uso de dos gradientes con diferentes rangos de concentración de disolvente. Ejemplos de tampones de elución adecuados para su uso en el presente documento pueden incluir, pero no se limitan a, acetato de amoníaco y soluciones de acetonitrilo.

Técnicas de purificación cromatografía de interacción hidrófoba Cromatografía de interacción hidrófoba HIC se puede realizar en el polipéptido diabetes por glucosilación cotraduccional insulina. Matrices HIC adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, matrices sustituidos por alquilo o arilo, tales como butilo, hexilo, octilo o matrices sustituidos por fenilo incluyendo agarosa, agarosa reticulada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, matrices poli metacrilatoy resinas de modo mixto, incluyendo, diabetes por glucosilación cotraduccional no limitado a, una resina de polietilenamina o un matriz poli metacrilato sustutuido por butilo read more fenilo.

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El sulfato de amoníaco se puede utilizar como el tampón para la carga de la columna de Diabetes por glucosilación cotraduccional. Un gradiente decreciente lineal de sal usando, por ejemplo, un gradiente de fosfato de potasio, también se puede usar para eluir las moléculas de insulina.

Modificación postraduccional

El eluyente puede entonces ser concentrado, por ejemplo, por filtración tales como diafiltración o ultrafiltración. La diafiltración se puede utilizar para eliminar la sal utilizada para eluir el polipéptido de insulina. El rendimiento de polipéptido de insulina, incluyendo polipéptido de insulina sustancialmente purificada, puede monitorizarse en cada diabetes por glucosilación cotraduccional descrita en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos normales en la técnica.

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Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden generar contra proteínas aisladas de fermentación de levadura de control negativo y la recuperación de intercambio catiónico. Los anticuerpos también se pueden usar para sondear la presencia de proteínas contaminantes de la célula huésped.

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Después de que estas sustancias han sido lavadas, impurezas se eliminan por lavado de la columna con tampón de acetato a un pH bajo. A continuación, la columna se lava con tampón de fosfato neutro y polipéptido de insulina se diabetes por glucosilación cotraduccional con un tampón con un aumento de la fuerza iónica.

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Las fracciones reunidas del eluato de HPLC se cargan y se lavan la columna con tampón de equilibrado. A continuación, la columna se lava con tampón de lavado tampón de acetato de sodio seguido de lavado con tampón de equilibrado. diabetes por glucosilación cotraduccional

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Métodos adicionales que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, etapas para eliminar endotoxinas. Los métodos para reducir los niveles de endotoxinas son conocidos para un experto normal en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de purificación utilizando soportes de sílice, polvo de vidrio o de hidroxiapatita, fase reversa, de afinidad, de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de click here hidrófoba, una combinación de estos métodos, y diabetes por glucosilación cotraduccional.

Modificaciones o métodos adicionales pueden ser necesarios para eliminar los contaminantes tales como proteínas comigratorias del polipéptido de interés. Los métodos para medir los niveles de endotoxinas son conocidos para un experto normal en la técnica e incluyen, pero no se limitan a ensayos, limulus lisado de amebocitos LAL.

Los métodos alternativos incluyen, pero no se limitan a, un método cinético LAL que es turbiométrico y utiliza un formato de 96 pocillos. Diabetes por glucosilación cotraduccional método in vivo, denominado incorporación de presión selectiva, se desarrolló para explotar la promiscuidad de sintetasas de tipo silvestre.

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